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环球体育app官网:还会盲目用药 ? 著名期刊发文证实乙肝一线药物替诺福韦耐药
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  研究者通过HBV病毒P区的突变检测并进行体外假病毒合成转染肝细胞培养药敏实验,发现四种突变组合CYEI与TDF的耐药有关。

  文章报道了2例慢性乙肝患者在服用替诺福韦(TDF)单药以及联合拉米夫定(LAM)/恩替卡韦(ETV)/替比夫定(LdT)期间产生表型耐药(病毒学突破/反弹)。研究者通过HBV病毒P区的突变检测并进行体外假病毒合成转染肝细胞培养药敏实验,发现四种突变组合CYEI与TDF的耐药有关。

  患者B:(图1B)66岁,男性。慢性乙型肝炎患者。2006年1月至12月,接受LAM治疗1年。2007年6月因HBeAg阳性,改用ETV(0.5 mg/d)治疗,在2009年5月时出现ETV耐药。2009年6月至2012年7月,改用ADV(10mg/d)+LAM((100 mg/d))联合治疗。2012年7月又发生病毒学突破,治疗方案改为TDF (300 mg/d)+LdT(600 mg/d)联合治疗。2013年9月随访丢失。直到2014年6月,患者开始接受TDF单药治疗,病毒完全被抑制。2017年6月,再次发生病毒学突破,血清HBV DNA为6.94×106IU/mL。本研究所用的血液样本为该时间抽取。该患者于2017年9月死于肝癌。由于该患者主要在当地的私人诊所接受治疗,没有具体的抗病毒药物耐药突变检测结果。

  (2)研究方法 研究者采集这2例患者服用TDF(单药或联合其他药物)后发生病毒学突破的血液进行测序,鉴定HBV突变情况;接着,他们分离病人HBV不同病毒株克隆进行药敏分析,评估和筛选可能与TDF耐药相关的突变;然后,对筛选出来的突变人工合成不同突变组合的克隆,最后通过药物实验分析找出与TDF耐药最相关的突变。

  患者A在服用含TDF的抗病毒药物后发生病毒学突破,抽取此时血清获取HBV的DNA,构建含病人HBV rt区的HBV1.2mers载体,得到8个克隆(克隆1-1、1-2、1-3、1-4、1-6、1-7、1-8和1-13),测序分析每个克隆整个RT基因的准种。 结果显示:8个克隆中,有4个克隆的RT区序列相同,表明优势HBV克隆已经突变(表1)。

  为了评估从患者分离培养病毒株的突变与TDF耐药的关系,本研究对典型的突变体(1-1和1-13)进行了体外药敏实验。分别将野生型、1-1和1-13的HBV1.2mers转入huh7细胞,随后进行细胞复制能力和药物敏感性的测验。southern结果显示(图2A):在一定浓度TDF作用下,野生型的复制大大降低,表明野生型对TDF敏感,而1-1和1-13克隆的复制并未显著降低,HBsAg和HBeAg的水平也无明显变化,表明1-1和1-13克隆对TDF不敏感。荧光定量PCR结果(图2B)显示IC50值,克隆1-1(91.8±0.2μM)和克隆1-13(92.2±0.3μM)比野生型(3.8±0.6μM)高24倍多,表明克隆1-1和1-13对TDF有很强的耐药作用。

  为了鉴定克隆1-1和1-13的突变特征,本研究通过定点突变构建了11个含有上述7个共同突变不同组合的克隆(C、E、CY、CE、YE、CYE、CYEI、MV、CYEMV、CYELMV和CYELMVI)。转染肝细胞并进行药物处理分析。从Southern blot结果来看(图3B):C, E, CY, CE, YE和MV对TDF敏感,CYE对TDF敏感性显著降低,而且,CYE加上rtL269I(I)后,其复制能力也明显增强,并出现表型耐药。

  实时荧光定量PCR(图3C)结果显示: CYE突变的IC50值是野生型的3.7倍,CYEI突变的IC50值是野生型的15.3倍;CYE的IC90 值是野生型的6.2倍,CYEI的是野生型的26.3倍。此外,恩替卡韦耐药突变LMV加上CYEI后,能增强LMV对TDF的耐药。

  为了比较不同突变的复制能力和耐药的效果,用实时PCR数据绘制了抗性倍数(IC50和IC90)与相对复制关系图(图4DE)。结果显示:CYE加上I后病毒复制能力及TDF耐药大大增强,CY加E后会强烈抑制复制,但增加L或I突变后增强复制,意味着这些突变发挥着CYE的补偿性突变的作用。

  ETV:野生型和CYE或CYEI病毒突变对ETV敏感,但CYELMVI突变对ETV和ETV/TDF联用强耐药(IC50=4.37μM)。 克隆1-1因含有CYEI和其他突变(rtL80I+rtM204I+rtQ267L),对ETV单药(IC50=1.22 μM)及ETV/TDF联用均耐药,且比克隆1-13的复制能力更高。 这些结果可以解释病人A在ETV/TDF联合治疗期间发生病毒学突破后,克隆1-1成为优势克隆的原因。 NVR3-778:所有的TDF耐药突变(无论是否同时含有ETV耐药突变)对衣壳组装调节剂NVR3-778均敏感,敏感性和野生型相近(IC50=0.44 μM)。

  ③ 文章结论本研究鉴定了2例TDF临床耐药的乙肝病人血清中一种四重TDF耐药突变,并在体外验证其对TDF耐药。据我们所知,这是首次从临床和体外方面报道HBV TDF耐药突变,CYE三突变降低了TDF的敏感性,CYEI四突变对TDF完全耐药。CYEI+LMV增强HBV复制能力,且对ETV和TDF+ETV耐药。CYEI(±MLV)突变以及对TDF耐药的HBV突变病毒株对NVR3-778敏感。

  (1) 目前研究的大部分乙肝病人都使用过多种药物,初治开始就只使用TDF单药治疗的病例还很少,且随访时间也不够长,所以TDF单药耐药的证据还不十分充足,针对耐多药HBV菌株的临床指南也很有限。 但由于HBV DNA高复制的特点且缺乏酶校正功能,使得HBV碱基突变频率高,因此使用NAs治疗乙肝,包括TDF,都有发展为耐药的风险,尤其是在耐多药HBV菌株中耐药更容易发生。

  (2)近几年,关于TDF不敏感的研究相继被报道,地坛医院就明确报道了TDF有耐药,且越来越多新发现的突变被证实与TDF耐药有关。 因此,临床上一旦出现服用TDF效果不佳的案例要特别关注,了解病人用药史和依从性,及时进行P区DNA测序,以了解患者体内病毒变异情况,选择合理的治疗方案。

  (3)ETV和TDF是乙肝抗病毒治疗一线药物,效果好,但针对每一位患者,这两种药怎么选?如果都耐药了,患者该怎么办? 文献中的病例B纯经验用药,用药混乱无明显依据,最终死亡;病例A在发生病毒学突破后进行耐药检测,并据

  此更换治疗方案,但遗憾的是该患者在长期的抗病毒治疗过程中对LAM、ETV和TDF均已耐药,已无更有效的药物可用。 如果患者在初治时先进行耐药检测,制定最佳的治疗方案、疗过程中实时耐药监测、治疗不佳时及时耐药检测突变情况,更换更合适的方案,或许可以避免或减缓耐药的发生,为患者争取更好的治疗机会。 正因为药物的选择不多,用药更需谨慎。

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